Cell viability는 세포 기반 연구에서 가장 널리 사용되는 평가 지표 중 하나이지만, 그 개념은 종종 과도하게 단순화되어 해석됩니다. 일반적으로 viability는 세포의 생존 여부를 의미하는 것으로 이해되지만, 실제로 대부분의 assay 및 staining 방법은 세포 생존을 직접 측정하지 않습니다.
대신, 이러한 방법들은 세포막 무결성(membrane integrity), 핵 접근성(nucleic acid accessibility), 세포 내 효소 활성(intracellular enzymatic activity), 대사 상태(metabolic competence)와 같은 특정 생물학적 특성을 기반으로 신호를 생성합니다. 이러한 지표들은 서로 독립적이며, 세포 사멸 과정의 서로 다른 단계에서 비동기적으로 변화합니다.
예를 들어, apoptosis의 초기 단계에서는 세포막이 유지된 상태에서 대사 변화가 먼저 나타날 수 있으며, necrosis에서는 membrane integrity의 손상이 주요 특징으로 나타납니다. 따라서 동일한 세포 집단에서도 선택된 assay 또는 stain에 따라 상이한 결과가 도출될 수 있습니다.
이러한 점에서, cell viability staining은 단순한 live/dead 판별 도구가 아니라 특정 biological endpoint를 선택적으로 반영하는 분석 방법으로 이해되어야 합니다.
따라서 stain의 선택은 단순한 생존 여부의 판별이 아니라, 측정하고자 하는 생물학적 지표에 대한 명확한 정의를 기반으로 이루어져야 합니다.
본 문서에서는 이러한 관점에서 cell viability stain을 작용 원리와 측정 대상에 따라 구분하고, 각 방법의 생물학적 의미와 적용 범위를 기술합니다.
이러한 개념적 차이는 다음 Figure를 통해 보다 직관적으로 이해할 수 있습니다.
Figure 1. Distinct biological endpoints measured by cell viability stains
Cell viability staining에 사용되는 주요 dye는 서로 다른 생물학적 지표를 기반으로 세포 상태를 반영합니다. Calcein AM은 세포 내 esterase 활성을 기반으로 live cell에서 형광 신호를 나타내며, propidium iodide (PI)는 세포막 무결성이 손상된 경우에만 세포 내부로 유입되어 nucleic acid에 결합합니다. DAPI는 세포의 생존 여부와 관계없이 핵을 염색합니다. 이러한 특성으로 인해 동일한 세포 집단에서도 각 dye에 따라 서로 다른 결과가 나타날 수 있으며, 각 staining 결과는 cell survival 자체가 아니라 특정 biological state를 반영하는 지표로 해석되어야 합니다.
대표적인 dye로는 Trypan blue와 Erythrosin B가 있습니다.
Trypan blue와 Erythrosin B는 세포막의 선택적 투과성을 기반으로 작용하는 dye로, membrane integrity가 손상된 세포에 선택적으로 유입됩니다. 정상적인 세포는 intact plasma membrane을 유지하기 때문에 dye의 유입이 제한되며, 이에 따라 live cell은 염색되지 않은 상태로 관찰됩니다.
이러한 특성으로 인해 해당 dye는 membrane integrity 기반의 가장 단순한 viability 평가 방법으로 사용되며, 특히 cell counting 과정에서 널리 활용됩니다.
그러나 이 접근법은 membrane 손상이 발생한 이후의 상태만을 반영하므로, 초기 apoptosis 단계 또는 metabolic 변화와 같은 기능적 변화를 반영하지 못합니다. 또한 단일 지표에 의존하기 때문에 세포 상태에 대한 정보는 제한적입니다.
대표적으로 Acridine Orange (AO), DAPI, SYTO9과 같은 dye가 사용됩니다.
이들 dye는 세포막을 통과하여 세포 내 nucleic acid에 결합하며, 세포의 생존 여부와 관계없이 전체 세포를 염색합니다. 이러한 결합은 intercalation 또는 electrostatic interaction을 기반으로 이루어지며, fluorescence signal을 통해 세포 핵의 위치와 형태, 그리고 전체 세포 수를 정량적으로 분석할 수 있습니다.
이러한 특성으로 인해 해당 dye는 전체 cell population 분석 및 imaging 기반 segmentation에 적합하며, high-content analysis에서 널리 활용됩니다.
그러나 nucleic acid staining은 membrane integrity 또는 세포의 기능적 상태를 반영하지 않기 때문에, 단독으로는 viability를 평가하는 지표로 사용하기 어렵습니다. 따라서 일반적으로 cell impermeable dye 또는 기능적 지표를 반영하는 dye와 병용하여 사용됩니다.
대표적인 dye로는 Propidium iodide (PI), SYTOX, Ethidium homodimer (EthD)가 있습니다.
이들 dye는 intact membrane을 통과하지 못하는 물리화학적 특성을 가지며, 세포막이 손상된 경우에만 세포 내부로 유입됩니다. 유입된 dye는 nucleic acid에 결합하여 강한 fluorescence signal을 생성하며, 이를 통해 membrane integrity가 손상된 세포를 선택적으로 검출할 수 있습니다.
Propidium iodide (PI)는 대표적인 DNA intercalating dye로, fluorescence imaging 및 flow cytometry에서 널리 사용됩니다. 해당 dye는 dead cell detection에 높은 특이성을 가지며, 비교적 간단한 staining protocol로 적용 가능합니다.
그러나 PI staining은 membrane integrity 손상을 기준으로 하기 때문에 early apoptosis 단계에서는 신호가 나타나지 않습니다. 또한 RNA와 결합하는 특성으로 인해 RNase 처리가 이루어지지 않을 경우 background signal이 증가할 수 있으며, 실험 조건에 따라 signal variability가 발생할 수 있습니다.
따라서 PI는 cell death 전체를 대표하는 지표라기보다는, late-stage apoptosis 또는 necrosis를 반영하는 marker로 해석하는 것이 적절합니다.
Figure 2. Membrane integrity-dependent dye uptake
Propidium iodide (PI)와 같은 impermeable nucleic acid dye는 정상적인 세포막을 통과하지 못하며, 세포막 무결성이 유지된 상태에서는 세포 내부로 유입되지 않습니다. 반면, 세포막이 손상된 경우에는 dye가 세포 내부로 확산되어 nucleic acid에 결합하고 형광 신호를 나타냅니다. 이러한 특성으로 인해 PI staining은 세포의 생존 여부 자체보다는 membrane integrity의 손실 여부를 반영하는 지표로 해석되어야 합니다.
대표적인 dye로는 Fluorescein diacetate (FDA)와 Calcein AM이 있습니다.
이들 dye는 비형광 상태로 세포막을 통과한 후, 세포 내 esterase에 의해 가수분해되어 형광 물질로 전환됩니다. 이 과정은 세포막의 무결성과 intracellular enzymatic activity가 유지되는 경우에만 발생합니다.
예를 들어 Calcein AM은 세포 내 esterase에 의해 cleavage된 이후 calcein으로 전환되며, 세포질 내에 축적되어 안정적인 fluorescence signal을 나타냅니다.
이러한 특성으로 인해 해당 dye는 live cell을 선택적으로 검출할 수 있으며, 세포의 기능적 상태를 반영한다는 점에서 유용합니다.
그러나 esterase activity는 metabolic 상태에 영향을 받기 때문에, signal 감소가 반드시 cell death를 의미하지는 않습니다. 예를 들어 세포가 생존해 있음에도 metabolic suppression이 발생한 경우 fluorescence signal이 감소할 수 있습니다.
따라서 해당 dye는 단순한 생존 여부보다는 functional viability 또는 metabolic competence를 반영하는 지표로 해석하는 것이 필요합니다.
각 staining 방법은 서로 다른 생물학적 지표를 반영하므로, 실험 목적에 따라 적절한 dye를 선택하거나 복합적으로 사용하는 것이 필요합니다.
단일 dye에 의존한 분석은 세포 상태를 부분적으로만 반영할 수 있으며, 특히 cytotoxicity, cytostasis, metabolic suppression과 같은 서로 다른 biological process를 구분하는 데 한계가 있습니다.
따라서 다음과 같은 조합이 일반적으로 사용됩니다.
Cell viability staining은 단일한 분석 개념이 아니라, 서로 다른 생물학적 상태를 반영하는 다양한 접근법의 집합입니다. 각 dye는 특정 작용 원리에 기반하여 제한된 범위의 정보를 제공하며, 동일한 실험 조건에서도 선택된 staining 방법에 따라 상이한 결과가 도출될 수 있습니다.
따라서 특정 dye로부터 얻어진 신호를 cell survival로 직접 해석하는 것은 생물학적 복잡성을 과도하게 단순화하는 접근일 수 있습니다.
보다 신뢰성 있는 분석을 위해서는 다음과 같은 요소가 필요합니다.
자세한 정보는 www.logosbio.com에서 확인하세요.
References
영어버전 (English ver.) 을 보시려면 클릭하세요.
