Single-Cell Sequencing을 위한 Nuclei Counting, 정확도를 높이는 실전 팁
염색 조합부터 cell size 데이터까지 — Sequencing 전 마지막 QC 체크포인트
scRNA-seq이나 snRNA-seq 라이브러리 준비를 앞두고 핵 현탁액을 counting하는 단계는 늘 조금 긴장됩니다. 대부분의 Sequencing 라이브러리 준비 프로토콜이 정해진 input concentration 범위를 요구하기 때문에, 여기서 농도나 순도를 잘못 판단하면 그 뒤로 이어지는 Sequencing 비용과 시간이 그대로 낭비될 수 있습니다.
Nuclei counting은 전체 워크플로우에서 정확히 어느 단계에 해당할까요? 저희 application note에서는 single-cell sequencing 워크플로우를 Tissue Collection → Isolated Cell(Nuclei) Preparation → Sequencing Library Preparation → Sequencing → Analysis의 5단계로 정리합니다. Counting은 이 중 Isolated Cell(Nuclei) Preparation 단계의 마지막, 즉 Sequencing Library Preparation 바로 직전에 자리합니다. 시료 준비의 마지막 관문이자, 라이브러리 준비에 들어갈 input 농도를 결정하는 단계인 셈입니다.
왜 세포가 아니라 핵을 분리해서 Sequencing 하는가
그런데 애초에 왜 세포가 아니라 핵을 분리해서 counting하고 있는 걸까요? Single-cell sequencing은 원칙적으로 온전한 세포(whole cell)를 대상으로 하지만, 뇌·지방·골격근 조직처럼 물리적으로 단일세포 수준까지 완전히 풀어내기 어려운 샘플이 많습니다. 무리하게 dissociation을 진행하면 그 과정 자체가 세포에 스트레스를 주어, 실제 조직 상태와는 다른 유전자 발현 패턴(dissociation artifact)이 나타날 수 있습니다. 또한 냉동 보관된 조직이나 biobank 샘플은 해동 과정에서 세포막이 이미 손상되어 있는 경우가 많아, 애초에 온전한 세포로 회수하는 것 자체가 어렵습니다. 이런 샘플에서는 세포 대신 핵만 분리해 snRNA-seq(single-nucleus RNA-seq)을 진행하는 것이 대안이 되며, 조직을 상대적으로 덜 가혹하게 처리하면서도 세포 유형 정보를 안정적으로 확보할 수 있어 최근 널리 쓰이고 있습니다.
왜 분리된 핵의 품질까지 확인해야 하나
문제는 ‘핵을 분리했다’와 ‘분리가 깨끗하게 끝났다’가 다른 이야기라는 점입니다. 분리 과정에서 일부 핵에는 세포질이나 막 잔여물이 그대로 남아있거나, 핵끼리 뭉쳐 클러스터를 이루는 경우가 흔합니다. 이런 상태를 그대로 counting하면 농도가 실제보다 부풀려질 수 있고, 라이브러리 준비 단계에서는 ambient RNA 오염으로 이어져 최종 Sequencing 데이터의 신뢰도까지 떨어뜨릴 수 있습니다. 그래서 counting 시점에 ‘핵이 몇 개인가’ 뿐 아니라 ‘얼마나 깨끗하게 분리되었는가’까지 함께 확인하는 것이 중요합니다.
핵 분리 품질, 어떻게 확인하나
다만 이 판단이 말처럼 간단하지는 않습니다. 핵은 죽은 세포와 마찬가지로 membrane-impermeable dye에 양성 신호를 보이기 때문에, 형광 신호만으로는 분리가 덜 된 핵과 완전히 분리된 핵, 심지어 죽은 세포까지도 눈으로 구분하기 쉽지 않습니다. 그래서 실제 실험실에서는 대개 세 가지 방법을 함께 씁니다. 첫째는 membrane-impermeable dye(PI, EthD-1 등)를 이용해 세포막이 실제로 제거되었는지 형광으로 확인하는 방법이고, 둘째는 핵이 온전한 세포보다 작다는 특징을 이용해 size 데이터로 분리 정도를 가늠하는 방법이며, 셋째는 brightfield 이미지를 직접 확인해 debris나 클러스터 여부를 판단하는 방법입니다. 이 세 가지를 함께 활용하면 형광 신호만으로는 놓치기 쉬운 부분까지 잡아낼 수 있습니다.
이 글에서는 저희 자체 application note 데이터를 바탕으로, 이 세 가지 축(dye, size, 이미지)을 기준으로 Single-Cell 워크플로우에서 nuclei counting의 정확도를 끌어올리는 실전 체크포인트를 정리했습니다. 소개하는 실험 데이터와 파라미터 설정값은 모두
LUNA-FX7™ Automated Cell Counter로 진행한 자사 실험 기준이며, 다른 장비를 사용 중이라면 설정값 자체보다는 ‘무엇을 확인해야 하는지’에 초점을 맞춰 참고하시길 권장합니다.
팁 1. Dye 조합부터 제대로 고르기
핵 품질 평가는 dye 조합을 제대로 고르는 데서 시작됩니다. 이론적으로 온전한 세포는 AO나 Calcein AM처럼 막을 통과하는 dye에만 반응하고, 세포막이 사라진 핵은 PI나 EthD-1처럼 막을 통과하지 못하는 dye에만 반응해야 합니다.
실제로 U937 세포와 3T3 세포를 대상으로 AO/PI, AO/EthD-1, Calcein AM/PI, Calcein AM/EthD-1 네 가지 조합을 비교했을 때, AO와 PI 또는 AO와 EthD-1의 조합이 온전한 세포와 분리된 핵의 viability를 가장 정확하게 구분해냈습니다. 반면 Calcein AM은 esterase 활성에 의존하는 dye라 세포 유형에 따라 신호 강도가 크게 달라졌습니다 — 3T3 세포에서는 Calcein AM 신호가 거의 관찰되지 않은 반면 U937 세포에서는 약 3분의 2만 신호를 보여, 일부 온전한 세포가 counting에서 누락될 위험이 있었습니다.
LUNA-FX7™에서 지원하는 염색 조합
LUNA 시리즈는 Green(AO 등)·Red(PI, EthD-1 등) 형광 채널만 지원하며, DAPI·Hoechst 33342 같은 Blue 파장 염색은 지원하지 않습니다.
따라서 nuclei counting에는 AO/PI 또는 AO/EthD-1 조합을 사용합니다. 온전한 세포는 AO(녹색)에, 분리된 핵은 PI 또는 EthD-1(적색)에 염색됩니다.
팁 2. Cell size 데이터로 분리 완성도 판정하기
핵은 세포막과 세포질이 제거된 상태이기 때문에 온전한 세포보다 유의하게 작게 측정됩니다. 이 크기 차이를 이용하면 핵 분리가 얼마나 진행되었는지를 정량적으로 판단할 수 있습니다. 아래는 저희가 실제로 진행한 두 건의 실험에서 AO/PI 염색 후
LUNA-FX7™로 측정한 average cell size 데이터입니다(Application note 참고).
| 세포주 |
온전한 세포 |
부분 분리된 핵 |
완전히 분리된 핵 |
| U937 |
12.5 ㎛ |
– |
5.6 ㎛ |
| 3T3 |
17.8 ㎛ |
– |
7.2 ㎛ |
| HL60 |
13.4 ㎛ |
10.2 ㎛ |
8.3 ㎛ |
U937·3T3 세포는 세포 용해 전후로 크기를 비교한 실험에서, HL60 세포는 분리 단계별로 미분리·부분 분리·완전 분리 샘플을 나누어 측정한 실험에서 얻은 값입니다. 특히 HL60의 경우 부분적으로만 분리된 핵이 평균 10.2 µm로, 완전히 분리된 핵(8.3 µm)과 온전한 세포(13.4 µm)의 중간값을 보였습니다. 즉 counting 결과와 함께 average cell size를 확인하면, ‘핵이라고 카운팅됐지만 사실은 분리가 덜 된 상태’를 구분해낼 수 있습니다.
LUNA-FX7™는 형광 강도가 아닌 brightfield 이미지에서 크기 정보를 추출하기 때문에, 염색 강도에 따른 크기 왜곡이 적어 이 판단의 신뢰도가 높습니다.
팁 3. Dead Cell과 Isolated Nuclei, 헷갈리기 쉬운 두 신호 구분하기
죽은 세포와 분리된 핵은 둘 다 세포막이 손상되었거나 아예 없는 상태라, PI 같은 membrane-impermeable dye에서 똑같이 붉은 신호를 냅니다. 형광 신호만으로는 두 상태를 구분할 수 없다는 뜻입니다.
이때 필요한 것이 brightfield 이미지 기반 size 정보입니다. 예를 들어 HeLa 세포에서는 온전한 세포와 분리된 핵의 평균 크기가 13.4 µm 대 6.4 µm로, HEK293 세포에서는 13.3 µm 대 11.7 µm로 뚜렷하게 구분되었습니다.
LUNA-FX7™는 이 크기 데이터를 함께 제공해, PI 양성 신호가 죽은 세포인지 분리된 핵인지를 이미지와 수치로 함께 확인할 수 있게 해줍니다.
팁 4. Sequencing 전, 응집·클러스터부터 체크하기
조직을 해리해 단일 세포 또는 핵 현탁액을 만드는 과정에서 일부 세포가 덩어리(cluster)로 남는 경우가 흔합니다. 실제 사례로, 불완전하게 해리된 AsPC-1 세포 샘플은 전체의 약 9%가 클러스터 상태로 남아 있었고 viability도 56%에 그쳐, 다운스트림 처리에 적합하지 않은 것으로 판정되었습니다. Cluster histogram 기능을 이용하면 이런 클러스터 비율을 라이브러리 준비 전에 수치로 확인할 수 있습니다.
이렇게 응집이 심한 샘플은 재해리를 먼저 시도하는 것이 기본이지만, 조직 특성상 완전한 단일세포 분리가 계속 어렵다면 핵 분리를 거쳐 nuclei counting으로 전환하는 것도 검토해볼 만한 대안입니다. 세포 경계가 아닌 핵막을 기준으로 counting하기 때문에 응집으로 인한 undercounting 영향을 줄일 수 있는 개연성이 있습니다. 다만 이는 세포 유형과 샘플 상태에 따라 달라질 수 있는 부분이라, 실제 적용 전에는 자체 샘플로 두 방법을 함께 확인해보는 것을 권장합니다.
팁 5. PFA로 고정한 핵을 다룰 때
장기 보관을 위해 핵을 PFA로 고정하는 경우, 염색 조합에 따라 결과가 달라질 수 있습니다. AO/PI 조합은 고정 여부나 염색 시간과 무관하게 안정적으로 강한 PI 신호를 보여, 신선한 핵과 고정된 핵 모두에 그대로 사용할 수 있습니다.
반면 AO/EthD-1 조합은 고정된 핵에서 적색 형광 신호가 약해지는 경향이 있어, 염색 시간을 늘려도 신호가 충분히 올라오지 않을 수 있습니다. 이 경우
LUNA-FX7™의 exposure 값을 기본 설정(5)에서 8로 높이면 AO/PI 조합과 비슷한 수준의 신호를 얻을 수 있었습니다. (다른 장비를 사용 중이라면 장비별 exposure·gain 설정에서 유사한 조정을 시도해볼 수 있습니다.)
팁 6 (보너스). FFPE 조직 유래 핵이라면 염색 전략을 바꿔야 한다
포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직에서 분리한 핵은 일반 신선 조직과 다르게 접근해야 합니다. 파라핀 제거와 추가 분리 단계를 거치면서 debris가 많이 발생하는데, AO 같은 membrane-permeable dye는 이 debris에 비특이적으로 결합해 노이즈를 만들어냅니다.
FFPE 핵 염색 시 주의할 점 (LUNA-FX7™ 기준)
AO/PI 조합은 FFPE 유래 핵에서는 권장되지 않습니다 — debris에 대한 AO의 비특이적 결합이 정확도를 떨어뜨립니다.
대신 PI 또는 YOYO-1 같은 single membrane-impermeable dye를 사용하고,
LUNA-FX7™의 LED 세팅을 최적화하는 것이 권장됩니다.
PI는 기본 RF LED 5에서 7로 높이면 신호가 개선되고, YOYO-1은 기본 GF LED 5에서 2로 낮추면 배경 노이즈가 줄어듭니다. (다른 장비라면 해당 장비의 형광 채널 강도 설정에서 유사하게 조정해볼 수 있습니다.)
팁 7. Settling Time과 SpectraSlide® AP-1로 워크플로우 단순화하기
splenocyte처럼 작고 밀도가 낮은 세포·핵은 슬라이드에 로딩한 직후 바로 이미징하면 아직 초점면에 완전히 가라앉지 못한 입자가 많아 counting 정확도가 떨어질 수 있습니다. Time-lapse 이미징으로 확인한 결과, 로딩 후 약 1~2분 정도 기다린 뒤 counting하면 이미지 선명도와 대비가 뚜렷하게 개선되어 이 짧은 settling time을 확보하는 것이 작은 입자를 다룰 때 중요한 체크포인트였습니다.
염색 준비 단계 자체를 줄이고 싶다면 AO/PI가 미리 코팅되어 있는 SpectraSlide® AP-1도 대안이 될 수 있습니다. Splenocyte와 isolated nuclei를 대상으로 기존 PhotonSlide™와 비교했을 때, viability 측정은 R² = 0.9997, concentration 측정은 splenocyte R² = 0.998, nuclei R² = 0.9995로 우수한 상관관계를 보여, 별도의 dye 준비 없이도 비교 가능한 정확도를 얻을 수 있었습니다. Debris가 많거나 viability가 낮은 조건에서도 live(녹색)·dead(적색) 신호가 안정적으로 구분되었습니다.
정확한 nuclei counting은 그 자체가 목적이 아니라, 값비싼 Sequencing 투자를 지키기 위한 마지막 QC 관문입니다. 염색 조합을 제대로 고르고, cell size 데이터로 분리 완성도를 확인하고, 클러스터 비율을 체크하고, 고정 여부에 맞는 설정을 쓰는 것 — 이 네 가지를 순서대로 짚어보는 습관이 실패한 Sequencing 런을 줄이는 가장 현실적인 방법입니다.
자주 묻는 질문 (FAQ)
Q. AO/PI와 AO/EthD-1 중 어떤 조합을 우선 써야 하나요?
A. 신선하게 분리한 핵이라면 두 조합 모두 무방합니다. 다만 PFA로 고정한 핵을 다룰 예정이라면 AO/PI가 더 안정적입니다. AO/EthD-1을 꼭 써야 한다면 고정 핵에서는
LUNA-FX7™의 exposure를 8로 조정하는 것을 권장합니다.
Q. Viability가 0 % 에 가깝게 나오는데, 실패한 실험인가요?
A. 핵 분리가 잘 이루어진 경우 정상적으로 나타나는 신호입니다. 세포막이 제거된 핵은 membrane-impermeable dye가 그대로 침투하기 때문에 viability가 0%에 가깝게 측정됩니다. 이 값만으로 판단하지 말고, average cell size가 예상되는 핵 크기 범위에 들어오는지 함께 확인하세요.
Q. LUNA-III™로도 nuclei counting이 가능한가요?
A. LUNA-III™는 명시야 전용 automated cell counter로 형광 채널이 없어 AO/PI 기반 nuclei counting을 지원하지 않습니다. AO/PI 또는 AO/EthD-1을 이용한 nuclei counting에는
LUNA-FX7™가 필요합니다.
References
- Application Note — Fluorescent Dyes and Automated Cell Counters: Towards Reliable Nuclei Quality in Single Cell Genomics. Logos Biosystems.
- Application Note — Automated Cell Evaluation for Single-Cell RNA-seq Analysis. Logos Biosystems.
- Application Note — Assessing Single Membrane-Impermeable Dyes for Nuclei Assessment Derived from Kidney FFPE Tissue Using the LUNA-FX7™. Logos Biosystems.
- Application Note — Evaluation of the SpectraSlide® AP-1 for Accurate Counting of Splenocytes and Isolated Nuclei. Logos Biosystems./li>
- Krishnaswami SR et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nat Protoc. 2016;11:499–524.
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