정확한 Cell Counting 을 위한 실전 가이드

: 흔하게 발생하는 4가지 cell counting 실수와 실험 신뢰도를 높이는 방법

세포 카운팅 (Cell counting)은 세포 생물학에 있어서 가장 중요한 부분 중 하나입니다. 96-well plate에 세포를 분주하거나, 형질감염 (transfection)을 준비하거나, 세포 증식을 모니터링 하는 등 어떠한 실험이든 정확한 cell count 는 실험의 성공 여부에 큰 영향을 미칩니다. 그러나 이처럼 일상적으로 수행하는 작업임에도 불구하고, 많은 연구자들은 자신도 모르게 실수를 반복하면서 데이터의 재현성과 신뢰도를 해치고 있습니다.

이 글에서는 셀카운팅 과정에서 흔히 발생하는 대표적인 실수 4가지와 이를 방지하기 위한 실용적인 방법들을 소개합니다.

1. Sample 혼합 부족으로 인한 세포 분포의 불균형

셀카운팅 과정에서 가장 흔하게 발생하는 실수 중 하나는 cell counting 전에 충분히 혼합하지 않는 것입니다. 세포는 특히, 실온에 방치할 경우, tube 나 well 바닥으로 빠르게 가라앉는 경향이 있습니다. 이로 인해 sample을 취하는 위치에 따라 세포 농도가 달라지고, 세포 계수 결과에 큰 편차가 발생할 수 있습니다.

왜 중요한가 ?

• 균일하게 혼합되지 않은 sample은 셀카운팅 결과에 큰 편차를 유발합니다.
• 이는 세포 분주 또 Viability assay 와 같은 이후 실험의 정확도에 영향을 줄 수 있습니다.

해결방법 :

• 셀카운팅 직전에 피펫팅이나 vortex 로 충분히 혼합하세요.
• トリパンブルー 와 같은 viability 염색약을 사용하는 경우에도, 염색 후 다시 한 번 혼합한 뒤 cell counting chamber에 주입하세요.

2. 희석 배율 계산 오류

トリパンブルー와 같은 염색약을 사용할 때, 많은 연구자들이 희석 배율 계산을 놓치는 실수를 하곤 합니다. 이러한 경우, 세포 계수 결과에 큰 오류가 발생할 수 있습니다.

또한, 세포 농도 계산 방법은 다음과 같습니다.

즉, 이로부터 계산된 부피는 다음과 같습니다.

해결 방법:

• 희석 배율 계산 시에는 총 부피와 cell sample의 부피를 정확하게 확인해야 합니다.
• 실험마다 희석 배율을 자주 바꾸지 말고, 항상 일관된 희석 조건과 계산 방식을 유지해야 계산 오류의 가능성을 줄일 수 있습니다.
• LUNA-III™ 나 LUNA-FX7™ 같은 자동 세포 계수기를 사용하는 경우, 측정 모드에 따라 표준 희석 배율이 자동 적용되어 있으며, 결과를 자동 저장할 수 있기 때문에, 사용자 오류를 줄이고 데이터의 추적성(traceability) 도 확보할 수 있습니다.

3. 세포 덩어리 (Clump) 나 이물질 (Debris)을 세포로 잘 못 계수하는 경우

세포 계수에서 또 다른 오류는 덩어리진 세포나 debris에 의해 발생할 수 있습니다. Clump를 단일 세포로 오인하거나, debris를 생존 세포로 오인할 수 있고, 이로 인해 총 세포 수나 생존율에 큰 편차가 생길 수 있습니다

왜 중요한가 ?

• 세포 clump는 단일 세포로 인식되어 계수 누락(undercount)이 발생할 수 있습니다.
• Debris이나 죽은 세포 조각이 살아있는 세포로 오인되어 과대 계수(overcount)로 이어질 수 있습니다.
• 이러한 오류는 생존율, 세포 분주할 때의 밀도(density) 조절 등에 영향을 주며, 이후 실험의 정확도와 재현성에 악영향을 미칠 수 있습니다.

해결 방법 :

• 세포가 clump로 뭉쳐 있다면, 피펫팅을 반복하거나 필요 시 trypsin을 희석하여 부드럽게 처리하세요.
• 필터링이 필요한 경우, 40 μm 메쉬 필터를 사용해 clump 나 debris를 제거하세요.
• LUNA-III™ 또는 LUNA-FX7™ 같은 자동 세포 계수기를 사용하는 경우, 사이즈 게이팅(size gating), 노이즈 제거, 감도 조절, 임계값 설정 등을 통해 정확도를 높일 수 있습니다.
• 특히 LUNA-FX7™ 에서는 고급 형광 모드에서 디클러스터링(declustering) 기능을 제공하여, 실제 단일 세포만 정확히 계수하는데 도움이 됩니다.

A549 (상단)와 COLON26L5 (하단) 세포를 Trypan blue로 염색하여 LUNA-FX7™의 명시야 생존율 모드(Brightfield Viable mode)로 촬영한 이미지입니다.

4. トリパンブルー 염색 후 counting 타이밍이 늦어질 때 생기는 문제

トリパンブルー는 생존율 분석에 널리 사용되지만, 염색 후 counting을 진행하는 타이밍이 매우 중요합니다. 일정 시간이 지나면 살아있는 세포도 염색약을 흡수하게 되어, 실제보다 낮은 생존율이 측정될 수 있습니다.

해결 방법 :

• トリパンブルー 염색 후 1~2분 이내로 세포 계수를 진행하세요.
• Counting chamber에 sample을 오래 방치하지 마세요.
• 더 정확하고 안정적인 생존율 분석을 위해 AO/PI 또는 FDA/PI와 같은 형광 기반 염색약 또는 Erythrosine B(EB)와 같은 명시야 대응형 염색제를 사용하는 것도 좋은 선택이 될 수 있습니다.

▶ 관련 콘텐츠 : How to choose the right viability stain for automated cell counting (Korean ver.)

자동화의 장점 :

LUNA-FX7™은 명시야 및 형광 모드를 모두 지원하여, 사용자들로 하여금 타이밍에 따른 오차, 사용자들 간의 편차를 줄이고 재현성을 높일 수 있게 합니다.

결론 : 반복되는 작은 편차가 실험 전체의 신뢰도를 결정합니다.

지금까지 소개한 네 가지 실수—혼합 부족, 희석 배율 오류, clump·debris 문제, 염색 후 계수 지연—은 모두 사소한 습관이나 프로토콜의 미세한 차이에서 발생합니다. 하지만 이처럼 반복되는 편차는 실험 결과의 정확도와 재현성에 중대한 영향을 미칠 수 있습니다.

특히 실험실 구성원 여러 명이 동일한 데이터를 다루거나, 수동 및 자동 계수기를 병행 사용하는 경우, 계수 방식·희석 조건· viability 기준이 조금씩만 달라도 실험 간 결과 비교가 어려워집니다. 또한, 장기적인 연구 데이터의 일관성과 신뢰도 또한 크게 떨어지게 됩니다.

해결 방법 :

• 실험실 차원의 표준화된 세포 계수 프로토콜(SOP)을 명확히 정의하고, 문서화하세요.
• 희석 비율, viability 기준, 로딩량, 계수 방식 등을 통일된 기준으로 설정하고 모든 사용자가 일관되게 따르도록 교육하세요.
• 자동 셀카운터를 사용할 경우, 분석 모드 및 파라미터도 고정값을 설정하여 사용자 간 편차를 최소화할 수 있습니다.

자동화를 통한 오류 최소화

수동 세포 계수는 시간이 많이 걸릴 뿐 아니라, 사용자 간의 편차와 피로로 인해 실수가 발생할 가능성이 높습니다. 숙련된 연구자라도 반복적인 적업에는 실수의 가능성이 존재합니다.

자동 세포 계수기는 다음과 같은 장점을 제공합니다.

• 자동 계산 및 사용자 오류 감소
• 고해상도 이미지 기반 세포 계수
• 사용자 간 표준화된 작업 방식 유지
• 명시야 및 형광 모드를 사용한 정밀한 생존율 분석
• 결과 데이터의 저장 및 추적 가능성 확보

마무리 : 정확한 세포 계수가 실험의 출발점입니다.

세포 계수는 단순해 보일 수 있지만, 사소한 실수 하나가 실험 전체에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 글에서 소개한 다섯 가지 흔한 실수를 피하고, 정확한 방법을 실천한다면 신뢰할 수 있는 실험 결과를 얻을 수 있습니다.

High throughput screening 이든, 세포 동결보관 준비이든, 정확한 세포 수 측정은 모든 실험의 기초입니다. 자동화는 더 이상 선택이 아닌, 실험의 정확성과 효율을 중시하는 연구실의 필수 도구입니다.

세포 계수 워크플로우를 업그레이드할 준비가 되셨나요 ?

정확하고 빠른 세포 계수를 위한 LUNA™ 시리즈 알아보기

자주 묻는 질문(FAQ)

Q1. 세포 수가 들쭉날쭉하거나, 동일한 sample 임에도 반복 측정 결과가 달라지는 이유는 무엇인가요 ?

A. 일반적으로 세포 샘플을 충분히 혼합하지 않거나, 희석 배율 계산에 실수가 있었던 경우, 혹은 clump(세포 덩어리) 나 debris(이물질)를 단일 세포로 잘못 인식했을 가능성이 있습니다. 특히, Hemocytometer를 이용한 수동 계수의 경우, 계수 기준이나 숙련도에 따라 사용자 간 편차가 발생할 수 있으며, 이로 인해 동일한 샘플에서도 결과가 달라질 수 있습니다.
이러한 편차를 줄이기 위해서는 계수 전 충분히 혼합하고, 일관된 계산 방식을 적용하고, 실험실 내 표준화된 절차(SOP)를 따르는 것이 중요합니다.
자동화된 계수기를 활용하면, 분석 조건을 고정하고 사용자 영향을 줄일 수 있어 보다 신뢰성 높은 결과를 얻을 수 있습니다.

Q2. 세포가 clumping (덩어리짐) 되면 어떻게 하나요 ?

A. 피펫으로 여러 번 섞어주거나, 필요한 경우 희석한 trypsin 을 사용해 부드럽게 풀어줄 수 있습니다. 상태가 심각한 경우에는 40 μm 메쉬 필터를 통해 물리적으로 제거할 수 있습니다. 덩어리진 세포는 수동 계수 시 사용자에 따라 인식 방식이 달라지기 쉽고, 이로 인해 생존율이나 세포 수 계산에 큰 편차가 생길 수 있습니다.

자동 계수기를 사용하는 경우, declustering 기능이 적용되어, 실제 단일 세포만 정확히 인식하고, 사용자 간 해석 차이를 줄일 수 있습니다.

영어 버전(English ver.)을 보시려면 클릭하세요.

Logos Biosystems는 다양한 실험 환경에 맞는 자동 세포 계수기 제품군을 제공합니다.
자세한 정보는 www.logosbio.com에서 확인하세요.