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Acridine Orange (아크리딘 오렌지,AO): AO는 분자량이 265 Da인 저분자로, 살아있는 세포와 죽은 세포 모두 침투할 수 있습니다. 세포 내부에 들어가면, AO는 선택적으로 핵산에 결합하고 특정 파장의 빛으로 excitation 시킬 경우 녹색 형광을 방출합니다. DNA에 결합된 AO는 약 500 nm의 최대 excitation 피크와 525 nm의 최대 emission 피크를 갖습니다.
Propidium Iodide (프로피듐 요오드화물, PI): PI는 분자량이 668 Da이며 살아있는 세포막을 통과할 수 없습니다. 대신 PI는 죽어가거나 죽은 세포와 같이 손상된 세포막을 통과할 수 있습니다. DNA에 결합된 PI는 약 535 nm의 최대 excitation 피크와 617 nm의 최대 emission 피크를 가지며, excitation 이후 적색 형광을 방출합니다.
AO/PI 혼합액을 세포에 처리한 뒤 해당 파장대의 광원으로 excitation 시킬 경우 살아있는 세포는 녹색 형광을, 죽은 세포는 적색 형광을 방출합니다. 구체적으로, AO는 모든 세포에 침투하여 핵산에 결합하는 반면, PI는 죽은 세포에만 침투하여 죽은 세포의 핵산에 결합합니다. 살아있는 세포는 AO만 통과시키기 때문에, 살아있는 세포에서는 PI의 형광이 관찰되지 않습니다. 죽은 세포에서는 두 염료 모두 침투할 수 있으며 이론적으로 AO와 PI의 형광이 모두 관찰될 수 있습니다. 그러나 FRET 현상 때문에, AO의 방출이 PI에 흡수되므로 죽은 세포에서는 AO와 PI가 함께 염색되어도 AO의 형광이 관찰되지 않고 오직 PI의 형광만 선택적으로 관찰됩니다. 만약 형광 현미경이나 형광 현미경 원리를 적용한 자동 세포 계수기를 사용할 경우, 살아있는 세포에서는 AO의 녹색 형광이 관찰되고 죽은 세포에서는 PI의 적색 형광이 관찰된다는 것을 의미합니다.
세포 준비:
① 배양세포에서 세포를 harvest 합니다.
② 원심분리기를 사용하여 세포를 collect 한 후 PBS로 재현탁합니다.
염색 과정:
① 10배 농축된 AO/PI 염색액을 준비합니다 (예: Acridine Orange/Propidium Iodide Stain, Cat # F20331, Logos Biosystems).
② 세포 현탁액 10 uL에 Acridine Orange/Propidium Iodide Stain 2 uL를 혼합합니다. AO/PI 의 염색시간은 매우 빨라서 별도의 incubation 이 필요치 않으므로 바로 카운팅할 수 있습니다.
세포 카운팅
형광 현미경 사용 시:
① 염색된 세포 10 uL를 Hemocytometer 에 주입합니다.
② 적절한 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하여 세포에 초점에 맞춥니다. 녹색 형광을 보이는 세포를 살아있는 세포로, 적색 형광을 띄는 세포를 죽은 세포로 카운팅합니다.
③ 세포 농도를 결정하기 위해 Hemocytometer 격자 중 큰 사각형 다섯개 에서 세포를 카운팅 합니다.
✓ Cell Concentration/mL = (사각형당 평균 세포 수/한 사각형의 부피(0.1 μL)) x 희석 계수
④ 세포 생존율 결정을 위한 공식:
% Viability = (녹색 형광을 발하는 세포 수/총 세포 수) x 100
자동 형광 세포 계수기 사용 시 (LUNA-FLTM),(LUNA-FX7TM)
① 염색된 세포 10 uL를 세포 계수용 챔버 슬라이드에 주입합니다 (예: PhotonSlide, Cat# L12005)
② 챔버 슬라이드를 장비에 삽입한 후 “Count” 버튼을 누릅니다.
③ 카운팅이 끝나면 자동 세포 계수기는 세포 농도, 세포 생존율, 세포 크기 등 필요한 모든 정보를 자동으로 표시합니다.
AO/PI 를 사용하여 세포 생존율을 측정할 때, 정확한 결과를 보장하기 위해 몇 가지 핵심 사항을 염두에 두어야 합니다. 다음은 기억해두면 유용한 팁들입니다:
Dye 농도의 일관성: AO와 PI의 농도는 실험 전반에 걸쳐 변함이 없어야 비교 가능한 결과를 얻을 수 있습니다. 염료 농도의 변화는 염색 강도와 살아 있는 세포와 죽은 세포의 구분에 영향을 줄 수 있습니다.
차광: AO와 PI는 빛에 민감합니다. 염료의 분해나 광표백을 방지하기 위해 항상 어두운 곳이나 희미한 빛 아래에서 보관하세요. 세포에 처리하기 위해 짧은 시간 빛에 노출되는 것은 괜찮습니다만 장기 보관시 차광은 필수적입니다.
시간 관리: AO/PI 염색 과정은 비교적 빠릅니다. 세포를 염료에 장시간 노출시키면 부정확한 결과를 초래할 수 있습니다. 샘플 간 염색 시간을 일관되게 유지하는 것이 중요합니다.
샘플 처리: 세포 현탁액을 염료와 부드럽게 섞는 것이 세포 손상을 방지하고 균일한 염색을 보장하기 위해 필수적입니다. 그러나 세포에 손상을 초래할 수 있는 격렬한 mixing 방법은 피하세요.
현미경 세팅: 형광 현미경이 AO(녹색 형광)와 PI(적색 형광) 관찰에 맞는 필터 세트를 갖추고 있는지 확인하세요.
유통기한: 염료 용액의 유통 기한을 확인하세요. 시간이 지남에 따라 염료가 분해되거나 오염될 수 있으며, 이는 염색 효율에 영향을 줄 수 있습니다.
장비의 보정 및 Control 물질: 자동 세포 계수기를 사용할 때, control 물질로 세포 계수기가 보정되어 있는지 확인하세요. Control 물질로는 알려진 농도의 형광 비드 혼합물 또는 자동세포 카운터 전용 캘리브레이션 슬라이드를 사용하세요.
다른 염색법 이용한 재검증: 예상치 못한 결과를 관찰하거나 결과가 중요한 의미를 가질 경우, 다른 염색 방법으로 AO/PI 염색 결과를 검증하는 것이 좋습니다.
기억하세요, AO/PI 염색은 세포 생존율을 평가하는데 유용하고 빠른 기술이지만, 정확하고 재현 가능한 결과를 얻기 위해서는 표준화된 절차를 유지하는 것이 필수적입니다.
세포 생존율 측정을 위한 최고 품질의 시약을 찾으신다면 www.logosbio.com을 방문하세요.
