세포 사멸(Cell Death) 이란 무엇인가? Apoptosis, Necrosis, Necroptosis의 실험적 구분에 대하여

세포 사멸(Cell death)은 생명 현상을 이해하고 질병의 기전(Mechanism of Action, MOA), 약물 반응성 등을 연구하는 데 필수적인 근본 과정입니다. 연구 결과의 신뢰도를 높이려면, 단순히 ‘세포가 죽었다’를 넘어 ‘어떤 경로(pathway)’로 사멸했는지를 정확히 규명해야 합니다.

본 포스팅에서는 가장 중요한 세 가지 세포 사멸 형태인 apoptosis, necrosis, necroptosis를 ‘세포 사멸(Cell death) 3대장’으로 명명하고, 이들을 형태적(morphological) 및 생화학적(biochemical) 관점에서 심층 비교하며, 무엇보다 연구실에서 실험적으로 명확히 구분하는 방법에 대해 자세히 다루겠습니다.

Figure 1. 세포 사멸 3대장의 형태학적 특징 비교

1. Programmed Cell Death: Apoptosis (계획된 세포 자살)

Apoptosis는 세포가 자신의 생명을 능동적이고 제어된 방식으로 끝내는 과정(programmed cell death) 이며, 주변 환경에 피해를 최소화하며 비교적 “조용히” 제거된다는 특징이 있습니다.

형태적 특징 (Morphological features)

세포 크기 수축(shrinkage)
세포막이 돌출(blebbing)되며 apoptotic bodies 형성
핵 염색질 응축(chromatin condensation) 및 핵 분절화(nuclear fragmentation)
세포막 무결성 유지 (초기 단계)

생화학적 특징 (Biochemical features)

Caspase 활성화 : Caspase-3/7 등이 핵심 실행자(executioner)로 작용
DNA laddering : DNA가 약 180-200 bp 단위로 규칙적으로 절단
Phosphatidylserine(PS) 외부 노출 : 세포막 인지질인 PS가 세포막 외부로 전위(flipping)
에너지(ATP) 의존적 신호/과정(상황에 따라 변화 가능)

주요 유발 요인

발생 과정 중 불필요한 세포 제거
DNA 손상
성장 인자(growth factor) 결핍
세포 독성 T세포에 의한 공격

염증 반응

Figure 2. Apoptosis의 단계별 형태 변화

2. Unregulated Cell Death: Necrosis (무작위적인 괴사)

Necrosis는 심각한 손상(독소, 외상, 극심한 스트레스 등)에 의해 세포가 제어 불가능하게 파괴되는 양상을 전통적으로 지칭합니다.

형태적 특징

세포 및 소기관 팽창(swelling)
세포막 파열(lysis) 및 세포 내용물 유출
핵 응축 없이 핵 용해(karyolysis)

생화학적 특징

Caspase 비활성화
ATP 급격한 고갈 : 에너지 부족으로 인한 이온 펌프 기능 상실
DNA 절단 무작위 발생 : gel 전기영동 시 smear 형태로 관찰
세포막 투과성 증가

주요 유발 요인

물리적 외상
독소 노출
허혈/저산소증
극단적인 온도 변화
대사 장애

염증 반응

Necrosis는 세포막이 빠르게 파열되면서 세포 내 구성물질이 바깥으로 유출되기 때문에, DAMPs(damage-associated molecular patterns)가 주변 면역계를 자극해 강한 염증 반응을 유발하는 경우가 많습니다. 즉, 염증 반응의 강도는 ‘죽음의 이름’보다도 ‘세포막 무결성이 언제 깨지느냐(얼마나 lytic 하게 끝나느냐)’와 밀접하게 연결됩니다.

Figure 3. Necrosis의 단계별 형태 변화

3. Programmed Necrosis: Necroptosis (조절된 괴사)

Necroptosis는 형태적으로는 necrosis와 유사하게 세포가 팽창하고 세포막 무결성이 무너지며 내용물이 유출되는 lytic cell death(막 파열형 사멸) 양상을 보일 수 있지만, 특정 신호 전달 경로에 의해 조절(regulated/programmed)된다는 점에서 다릅니다. 특히, apoptosis 경로가 억제되거나(예: caspase-8 기능 저하/억제) 특정 자극 조건에서 활성화될 수 있어 방어 또는 병리 기전으로 주목받고 있습니다.
또한 necroptosis는 현미경에서 보이는 형태가 necrosis와 매우 비슷하기 때문에, 형태학적 관찰만으로 두 경로를 명확히 구분하기는 어렵고, 분자 마커 또는 기능적 검증을 함께 사용하는 접근이 일반적입니다.

형태적인 특징

Necrosis와 유사하게 세포 팽창 및 파열
세포막 무결성 상실
소기관 팽창

생화학적 특징

Caspase 비의존적 경향 : Caspase-8 억제/비활성 조건에서 necroptosis가 두드러질 수 있음
RIPK3-MLKL 축 활성화(대표 경로) :

(조건에 따라) RIPK1이 upstream에서 관여하고, RIPK3 활성화 및 necrosome 형성이 촉진될 수 있음
MLKL(mixed lineage kinase-like)이 핵심 실행자(executioner)로 작동
MLKL의 인산화(phosphorylation)및 중합(oligomerization)이 세포막 손상을 유도하여 lytic cell death로 이어짐.

초기 신호 전달 및 복합체 형성 단계는 에너지(ATP)에 의존적이며, 진행 과정에서 에너지 상태는 조건과 시간에 따라 변할 수 있음

주요 유발 요인

TNF-α, FasL 등 death receptor 활성화 (특히 caspase-8 억제 상황)
바이러스 감염 (세포가 apoptosis를 회피할 때 백업 메커니즘)
허혈/재관류 손상

염증 반응

Necroptosis 역시 최종적으로는 세포막 무결성이 무너지며 내용물이 유출되는 lytic end-stage로 진행할 수 있어, 결과적으로 주변 조직에 염증 반응을 유발하기 쉽습니다. 이런 점에서 “조용히 정리되는” apoptosis와 대비되며, 특히 감염 및 면역 질환, 허혈/재관류 손상 등의 맥락에서 중요한 병리 기전으로 다뤄집니다.

Figure 4. Necroptosis의 단계별 형태 변화

4. Cell Death 3대장 실험적 완벽 비교 (Assays for Distinction)

연구실에서 apoptosis/ necrosis/ necroptosis를 구분하려면, (1) 막 무결성/PS 노출 (phenotype), (2) 경로 마커 (molecular markers), (3) 억제제 또는 유전학적 검증(functional validation)을 조합하는 것이 가장 안전합니다. 단일 assay만으로 ‘확정’하는 것은 가급적 지양하는 편이 좋습니다.

A. 기본 분석법: Annexin V / PI 이중 염색 (Double staining)
Flow cytometry 또는 image-based cytometry에서 세포막 변화와 무결성을 동시에 확인하는 표준 방법입니다.

염색패턴 해석

Annexin V- / PI- : 정상 생존 세포
Annexin V+ / PI- : Early apoptosis (PS 노출 + 막 무결성 유지)
Annexin V- / PI+ : Primary necrosis-like/ membrane-compromised(막 손상) population (조건/시간축/염색 조건에 따라 PS 노출 신호가 약하게 잡힐 수 있어 추가 확인 권장)
Annexin V+ / PI+ : Late-stage apoptosis/ secondary necrosis/ regulated lytic death (necroptosis 등) 가능

Annexin V+ / PI+ 집단에서 Annexin V 신호는 “막이 무너진 뒤 내부 PS에 결합”한 결과일 수도 있어, Annexin V+ / PI+ 만으로 apoptotic이라 단정하면 위험합니다.

핵심 : Annexin V / PI는 “스냅샷 분류”로 매우 유용하지만, Annexin V+ / PI+는 반드시 추가 분석과 함께 해석하는 것이 안전합니다.

B. 특이 경로 확인: Western blotting 및 inhibitor assay
Apoptosis와 necroptosis를 구분하는데 유용하지만, 억제제는 조건 의존성과 off-target 가능성이 있어 “확정”보다는 경로 관여 여부를 뒷받침하는 기능적 근거로 활용하는 것이 권장됩니다.

1. Caspase assay

Caspase-3/7 활성을 측정하여 caspase-의존적 apoptosis가 관여했을 가능성을 확인합니다.

2. Inhibitor assay:

샘플에 Z-VAD-FMK (Caspase 억제제)를 처리했을 때 사멸이 감소하면 → caspase 의존성 사멸이 관여했을 가능성 증가
샘플에 Necrostatin-1 (RIPK1 억제제)를 처리했을 때 사멸이 감소하면 → RIPK1 의존적 regulated lytic death(necroptosis 포함) 가능성이 증가

→ 가능하다면 아래 Western blot 마커로 교차 확인하는 것이 안전합니다.

3. Western blotting

Apoptosis 마커 : Cleaved caspase-3, cleaved caspase-7, cleaved PARP
Necroptosis 마커 : p-RIPK3 및 p-MLKL 발현(또는 증가) 확인

→ Phospho-site는 종(species)과 항체에 따라 차이가 있을 수 있으므로, 사용 모델 (human/mouse)에 맞게 검증된 항체를 선택하는 것이 중요합니다. 또한, 가능하다면 total RIPK3, total MLKL도 함께 확인해 상대 변화를 보는 것이 좋습니다.

결론 및 연구 활용

Cell death pathway의 정확한 규명은 약물 작용 기전(MOA) 해석과 질병의 병태생리(pathophysiology) 연구에 중요한 역할을 합니다. Apoptosis, necrosis, necroptosis는 결과적으로 세포 사멸로 나타나더라도 막 무결성 변화 시점, 분자 신호, 염증 반응이 서로 달라 연구 해석에 큰 영향을 줄 수 있습니다. 또한 세포 사멸은 시간에 따라 지표가 바뀌고(예: apoptosis의 late-stage/secondary necrosis), necrosis와 necroptosis는 형태가 유사해 단일 관찰만으로 구분이 어려운 경우가 많습니다.

따라서 연구에서는 Annexin V / PI와 같은 phenotype 지표에 더해, caspase 활성/cleavage, p-MLKL 등 경로 특이 마커, 그리고 억제제 또는 유전학적 접근과 같은 기능적 검증을 조합해 종합적으로 해석하는 것이 신뢰도 높은 결론을 도출하는 데 도움이 됩니다.

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REFERENCES
1) Ferroptosis, Necroptosis, and Pyroptosis in Gastrointestinal Cancers: The Chief Culprits of Tumor Progression and Drug Resistance(2023), DOI: 10.1002/advs.202300824
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3) Mechanisms of Cell Death: Necrosis & Necroptosis | CST Blog
4) Yuan-Shen Chen, et al. Pan-Caspase Inhibitor zVAD Induces Necroptotic and Autophagic Cell Death in TLR3/4-Stimulated Macrophages, Molecules and Cells, Volume 45, Issue 4, 2022, Pages 257-272, ISSN 1016-8478,doi.org/10.14348/molcells.2021.0193
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7) Salah Abdalrazak Alshehade et al. Flow cytometry-based quantitative analysis of cellular protein expression in apoptosis subpopulations: A protocol, Heliyon, Volume 10, Issue 13, 2024, e33665, ISSN 2405-8440, https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2024.e33665.

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