자동 세포 카운팅 (Automated Cell Counting)을 위한 최적의 염색 시약 (Cell Viability Stain) 선택 방법 : TB, EB, AO/PI, FDA/PI 비교

정확한 세포 생존율 (cell viability)의 측정은 연구실의 일상적인 세포배양부터 신약 개발, 세포 치료제 생산에 이르기까지 대부분의 세포 기반 실험에서 매우 중요합니다. 수십 년 동안 Trypan Blue (TB, Cat.#T13001)는 세포막의 손상 여부를 기준으로 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하는 데 널리 활용되어 온 신뢰할 수 있는 방법이었습니다. Bleu de Trypan 염색은 수동 세포 계수에 적합하고, 접근성도 뛰어나 지금도 많은 실험실에서 꾸준히 사용되고 있습니다. 특히, 형광 장비 없이 빠르게 수동으로 세포 생존율을 측정해야 하는 상황에서, 편리한 시약으로 많이 사용되고 있습니다.
하지만 생물학적 분석이 점점 더 복잡해지고 다양한 종류의 세포 생존율을 측정이 필요하게 됨에 따라, Trypan Blue 의 한계도 점점 뚜렷해지고 있습니다. Typan Blue 염색으로는 샘플 내에 존재하는 세포 외의 물질들, 예를 들면 cell dedris나 적혈구와 같은 파티클들을 구분하기 어려운 경우가 많습니다. 여기에는 초대 배양 세포 (primary cells)나 줄기세포, 혈액세포와 같은 것들이 포함됩니다. 또한 높은 세포 독성으로 인해 짧은 시간 동안 염색을 하고 곧바로 카운팅해야 한다는 점에서 장시간 분석이 필요한 실험에는 적합하지 않습니다.
이에 대응하여, Erythrosin B (EB, Cat.#L13002)와 Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI, Cat.#F23001), Fluorescein Diacetate/Propidium Iodide (FDA/PI, Cat.#F23214)와 같은 염색 솔루션들이 대안으로 등장했습니다. 이러한 최신 방법들은 더 높은 안정성, 낮은 세포 독성, 자동 세포 계수 및 형광 플랫폼과 높은 호환성을 제공합니다.

1. Trypan Blue (TB) : 신뢰할 수 있지만 시간에 민감한 염색시약

Trypan Blue (TB, Cat.#T13001)는 디아조(diazo) 염료로, 죽은 세포에 선택적으로 침투하여 파란색으로 염색시키며, 반면에 살아있는 세포에서는 침투하지 못하는 특성이 있습니다. 주로 수동 세포 카운팅에서 헤모사이토미터 (hemocytometer)와 함께 사용되며, 빠른 세포 생존율 확인에 널리 활용됩니다. 즉시 관찰이 가능한 간단하고 짧은 실험에 적합하며, HeLa세포나 CHO세포와 같은 immortalized cell line (불멸화 세포주)에서는 충분히 효과적입니다.
하지만 초대 배양 세포 (primary cells)나 줄기세포, 혹은 배치 processing이나 카운팅해야하는 세포 샘플이 많아서 염색약에 장시간 노출이 되는 상황에서는 TB의 사용이 문제가 될 수 있습니다. 이러한 경우, TB 의 세포 독성 (cytotoxicity)과 시간 민감성 (time sensitivity)은 생존율 측정에 큰 변동성을 유발 할 수 있습니다.

아래 그래프에서 볼 수 있듯이, TB로 염색한 PBMC는 단 15분 만에 총 세포 수가 약 7 % 감소하고, 30분이 지나면 거의 20 %까지 감소하는 것으로 나타났습니다. 이는 해당 염색약의 세포 독성과 시간 민감성이 뚜렷하게 드러나는 부분으로, 생존율 기반 세포 계수카운팅 워크플로우에서 데이터 신뢰도를 저해할 수 있음을 보여줍니다.

PBMC + TB: 15분 경과 시 약 7% 감소, 30분 후에는 약 20% 감소 – 신호 민감도 저하 관찰됨.

2. Erythrosin B (EB) : 세포 카운팅를을 위한 더 안전한 염색 대안

Erythrosine B (EB, Cat.#L13002)는 TB와 유사하게 작용하는 붉은 색 염료지만, 세포독성이 훨씬 낮습니다. EB는 더 긴 판독 시간 (readout window)을 제공하며, 자동 이미지 기반 세포 계수 시스템과도 잘 호환됩니다. 또한, EB의 붉은 색상은 명시야 (brightfield) 이미징 시스템에서 시각적 대비를 개선하여, 자동화 장비가 쉽게 살아있는 세포와 죽은 세포를 판독하도록 도움을 줍니다.
EB는 세포를 바로 카운팅 할 수 없는 상황에서 효과적으로 활용될 수 있습니다. 예를 들어, 여러 샘플을 동시에 처리하거나 공용 이미징 장비를 사용할 때, EB는 TB보다 염색 안정성이 더 뛰어난 것으로 보고되어, 이미지를 획득하는 데 있어 지연될 수 있는 워크플로우에서도 일관성 있는 데이터를 얻을 수 있도록 합니다. 또한, EB는 iPSCs, 기타 초대 배양 세포 (primary cells)과 같이 TB에 의해 손상되기 쉬운 민감한 세포 유형에도 더 적합합니다.

장점:

• 세포 독성이 낮음
• 약 30분간 염색 안정성이 유지되는 것으로 보고됨
• 붉은 색상으로 인해 밝은 시야 (brightfield) 이미징에서 세포 검출이 용이할 수 있음.
• 명시야 기반 자동 세포 카운팅 시스템과 호환 가능

EB는 명시야 (brightfield) 이미징에서 TB와 유사한 수준의 이미지 품질을 제공하며, 자동 분석 워크플로우에서 세포를 정확하게 구분하고 식별하는데 효과적입니다.

U937 cell line stained with Trypan Blue (top) and Erythrosine (bottom), imaged using the LUNA-FX7 automated cell counter.

3. Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) : 정확한 세포 카운팅을 위한 이중 형광 염색

Acridine Orange (AO, Cat.#F23002)는 세포의 생존 상태에 상관없이 세포막을 투과하여 녹색 형광을 나타냅니다. 반면, Propidium Iodide (PI, Cat.#F23003)는 죽은 세포에만 침투해 붉은 형광을 나타냅니다. AO/PI는 이러한 두 가지 염료를 활용하여 형광 기반 세포 카운팅에서 살아있는 세포와 죽은 세포를 동시에 구분할 수 있게 해줍니다. 두 가지 형광 채널이 명확하게 구분되기 때문에, AO/PI 염색은 시간에 따른 생존율 변화를 추적해야 하는 실험이나, High-throughput screening 동적 실험 (kinetic assay) 등 다양한 목적에 유용합니다.
이 방법은 높은 안정성과 다양한 플랫폼과의 호환성 덕분에 연구 및 산업 현장 모두에서 널리 사용되고 있습니다. 또한 생존율이 다양한 샘플이나, 형광의 강도와 위치를 통해 초기 apoptosis 상태인지 확인 가능할 수 있는 경우에도 널리 활용됩니다.
AO/PI 염색이 분자 수준에서 어떻게 작용하는지, 실험 프로토콜과 모범 사례를 포함한 보다 깊이 있는 정보를 원하신다면, 다음 가이드를 참고하시기 바랍니다:
“ How to Measure Cell Viability Using Acridine Orange/Propidium Iodide: The Principle and the Procedure ”

장점:

• 매우 높은 민감도 (sensitivity)와 대비 (contrast)
• 실시간 이중 채널을 통한 생존율 분석

아래 그래프에서 볼 수 있듯이, AO/PI로 염색한 PBMCs는 30분 간 총 세포 수를 매우 안정적으로 유지됩니다. 이는 염색에 의한 세포 독성이 거의 없고, 시간 경과에도 총 세포 수가 안정적으로 유지됨을 나타냅니다. 따라서, AO/PI는 형광 기반 생존율 평가를 위한 세포 계수 워크플로우에서 신뢰할 수 있는 선택지임을 보여줍니다.

PBMC + AO/PI: 30분 동안 총 세포 수 안정적으로 유지. 생존율 변화 없음.

4. Fluorescein Diacetate/Propidium Iodide (FDA/PI) : 효소 기반 형광 염색법

Fluorescein Diacetate (FDA)는 형광을 띄지 않는 화합물이지만, 살아있는 세포 내의 Esterase 효소에 의해 녹색 형광을 내는 Fluorescein으로 전환됩니다. 한편, PI는 죽은 세포를 붉게 염색하여 이 두 가지 염색 시약의 조합으로 세포 생존율을 분석할 수 있습니다.
AO가 핵산에 직접 결합하는 방식인 방면, FDA는 세포 내 Esterase효소의 활성을 통해 형광을 나타내므로, 대사 기능이 살아있는 세포만 선택적으로 염색됩니다. 이러한 특성 때문에 FDA/PI는 세포 건강 상태에 대한 높은 특이성이 요구되는 실험에 매우 적합합니다. FDA/PI는 특히 효모처럼 크기가 작고 형광 신호가 약한 세포를 다루는 경우에 특히 유용합니다. 실제로 이 염색 방법은 효모세포의 형광 기반 생존율 분석에 최적화된 Logosbiosystems의 Yeast Viability Kit 1 (Cat.#F23202)의 핵심 원리로 사용되고 있습니다.
자세한 응용 데이터는 다음 어플리케이션 노트를 참고하시기 바랍니다.
“ Application Note : Fast Cell Counting and Viability Measurement of Yeast Cells with the LUNA-FL™ Fluorescence Cell Counter ”

FDA/PI가 주목받는 이유:

• 매우 낮은 세포 독성
• 효소 활성을 기반으로 한 살아 있는 세포의 선택적인 형광 신호
• 염색 유지 시간이 길어 유연한 실험 진행 가능
• 자동 세포 카운터와 뛰어난 호환성

결론

Trypan Blue (Cat.#T13001)는 오랫동안 널리 사용되어 온 염색 시약으로, 지금도 간단한 수동 세포 카운팅계수 워크플로우-특히 스트레스에 강한 세포주나 단기 실험-에서는 유용하게 쓰이고 있습니다. 그러나 민감한 초대 배양 세포(primary cell), 이미징 획득이 지연되는 상황, 또는 고처리량(hHigh-throughput) 분석이 필요한 경우에는 적합하지 않습니다.
정확성 향상과 세포 독성 감소, 자동화 시스템과의 호환성을 중요하게 생각하는 연구자라면, 대체 염색 시약들이 더 나은 선택이 될 수 있습니다.

• Erythrosin B (Cat.#L13002) 는 형광 장비 없이도 안전성과 염색 안정성을 높여, 수동 셀 카운팅계수에서 이미지 기반 계수로 전환하려는 실험실에 적합한 현실적인 대안이 될 수 있습니다.
• 반면, AO/PI (Cat.#F23001) 및 FDA/PI (Cat.#F23214) 는 형광 기반 자동 셀카운터와 같은 고급 분석 플랫폼에 적합합니다.

적절한 생존율 염색 시약을 선택하는 것은 단순히 익숙함의 문제가 아니라, 실험에 사용하는 샘플의 특성, 사용 장비, 실험 목적에 가장 잘 맞는 계수 방법을 찾는 것입니다.
보다 폭 넓은 정보와 생존율 분석 시약에 대한 가이드는 다음 자료를 참고하세요:
“ The Ultimate Guide to Cell Viability Measurement. ”

자주 묻는 질문 (FAQ)

Q1: PBMC 또는 iPSC와 같은 민감한 세포에 Trypan Blue를 사용할 수 있나요?
A: 추천하지 않습니다. TB는 세포 독성을 유발할 수 있기 때문에, EB 또는 AO/PI와 같은 염색 시약이 생존율을 더 잘 보존하는데 적합합니다.

Q2: FDA/PI는 모든 세포 유형에 적합한가요?
A: FDA/PI는 특히 효모(yeast)나 크기가 작고 형광 배경 신호가 약한 세포에 효과적입니다. 포유류 세포의 경우, 일반적으로 AO/PI가 더 선호됩니다.

Q3: EB와 AO/PI 중 어떤 것을 선택해야 하나요?
A: 형광 없이 명시야(brightfield) 세포 계수기를 사용하는 경우에는 EB, 형광 기반 탐지나 보다 정밀한 생존율 분석이 필요한 경우에는 AO/PI를 선택하는 것이 좋습니다.

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