세포 카운팅 표준 이해하기: ISO 20391-2

세포 카운팅에서의 실험 설계와 통계분석

서론: 왜 ISO 20391-2가 필요한가

세포 카운팅(cell counting)는 단순한 숫자 세기가 아니라, 연구와 임상에서 신뢰할 수 있는 데이터를 확보하는 출발점입니다. 신약의 효과 검증, 줄기세포 배양 모니터링, 세포치료제 제조와 같은 과정에서 세포 수 데이터는 결과의 신뢰성과 재현성을 좌우합니다.

하지만 현실에서는 같은 샘플을 두고도 연구자, 장비, 실험실에 따라 결과가 다르게 나타납니다. 이러한 불일치는 연구 재현성을 떨어뜨리고, 임상 현장에서는 환자 안전에도 위험을 초래할 수 있습니다.

이를 해결하기 위해 제정된 것이 ISO 20391 시리즈입니다.

• ISO 20391-1은 정확도(Accuracy), 정밀도(Precision), 불확도(Uncertainty)라는 핵심 개념과 IQ/OQ/PQ 절차를 통해 장비 성능 검증에 초점을 맞췄습니다
• ISO 20391-2는 한 단계 더 나아가, 실험 설계와 통계 분석을 통한 카운팅 방법(Method) 자체의 신뢰성 검증을 다룹니다.

즉, ISO 20391-1이 “장비가 제대로 작동하는가?”를 묻는다면, ISO 20391-2는 “그 카운팅 방법이 얼마나 신뢰할 수 있는가?”를 수치로 입증하는 규정이라고 할 수 있습니다.

ISO 20391-1 vs ISO 20391-2

	ISO 20391-1	ISO 20391-2
초점	장비 검증 (IQ/OQ/PQ)	세포 카운팅 방법 성능 검증 (실험, 통계)
목적	장비가 정상적으로 작동하는 가?	결과가 신뢰할 만 한가?
적용 범위	장비 설치, 작동 확인	실험 설계, 통계 분석, 성능 평가
주요 지표	적합성 여부	CV, R², PI 등 정량 지표

ISO 20391-2의 목적

ISO 20391-2의 가장 큰 목적은 세포 카운팅 방법의 성능을 정량적 지표로 검증하는 것입니다. 단순히 “세포 수를 세는 법을 알려주는 것”이 아니라, 그 카운팅 방법이 얼마나 신뢰할 수 있는지를 수치화 하여 입증할 수 있도록 하는 데 있습니다.

1. 연구 신뢰성 확보
   반복성 · 재현성을 수치화 하여 데이터가 일관되는지 증명할 수 있습니다.


2. 국제적 비교 가능성 강화
   동일한 언어와 지표로 연구실 간 결과를 비교할 수 있어 다기관 연구와 협업에 적합합니다.


3. 규제 및 산업 적용 지원
   세포치료제, 바이오의약품 제조 과정에서 QC 데이터의 국제적 통용성을 보장합니다.


4. 정량적 지표 도입
   CV, R², PI와 같은 지표로 참값이 없는 상황에서도 성능을 객관적으로 검증할 수 있습니다.

ISO 20391-2의 주요 개념 (Key Concepts)

ISO 20391-2는 단순히 세포를 세는 과정을 넘어서, 그 측정 과정이 얼마나 신뢰할 수 있는가를 평가하기 위해 다음과 같은 핵심 개념을 정의합니다.

1. 반복성 (Repeatability)
• 동일한 샘플을 같은 조건에서 여러 번 측정했을 때 결과가 일관되는 정도.
• 변이계수(CV, Coefficient of Variation)로 수치화.
• CV 값이 낮을수록 데이터가 안정적이고 카운팅 방법의 신뢰성이 높음을 의미.


2. 재현성 (Reproducibility)
• 다른 날짜, 다른 실험자, 다른 실험실에서 동일한 샘플을 측정하였을 때, 결과가 유사한지 여부.


3. 실험실 간 변동성 (Inter-laboratory variability)
• 여러 실험실에서 동일한 프로토콜로 실험했을 때 발생하는 차이를 평가.
• 다기관 연구나 규제 제출 데이터에서 특히 주요.


4. 통계적 분석 (Statistical Analysis)
• 변동성을 수치로 표현해 신뢰성을 입증.
• 변이계수(CV, Coefficient of Variation) : 정밀도 평가.
• 결정계수(R², Coefficient of Determination) : 희석 시리즈와 카운팅 결과의 선형성 및 적합도 평가.
• 비례성 지수(PI, Proportionality Index) : 카운팅 결과가 이론적 희석 비례 관계에서 얼마나 벗어나는지를 나타냄.

ISO 20391-2의 절차 (실험 설계와 통계 분석)

1. 실험 설계 (Experimental Design)
1. 희석 시리즈 설계 (Dilution Series)
• 단일 모 세포용액(또는 표준물질)에서 서로 다른 희석분율(Dilution fraction, DF) ≥ 4개를 설정합니다.
• The DFs should be arranged to evenly cover the operational concentration range (0 < DF ≤ 1), using either linear or logarithmic intervals.
  예 : 1, 1/2, 1/4, 1/8
• 각 DF 에서 독립 대표시료 ≥ 3개를 준비하고, 각 대표시료를 반복 측정 ≥ 3회 수행합니다.
• (권장) 측정 순서는 무작위화, DF 라벨은 비식(맹검) 처리합니다.


2. 시료 준비 (Sample Preparation)
• 각 희석 단계별로 독립적인 대표시료를 준비해야 합니다. (동일 모 시료에서부터 제조·취급을 분리)
• 피펫팅 오차, 세포 응집, 잔여물(debris)을 최소화합니다.
• 준비 → 측정까지의 시간을 전 DF 에 동일하게 적용합니다. (예 : 15분 이내)


3. 반복 측정 (Replicate Measurements)
• 각 희석 단계별 대표시료를 최소 3회 이상 반복 측정하는 것이 원칙입니다.

그림 1. 희석 시리즈 설계(ISO 20391-2).
모 시료(stock sample)를 여러 희석 단계(DF)로 나누고, 각 단계에서 독립적이 대표 시료를 준비한 뒤, 각 시료를 반복 측정(3회 이상)하는 방식입니다. 이 과정을 통해 반복성과 통계적 신뢰성을 동시에 확보할 수 있습니다. .

2. 통계 분석 (Statistical Analysis)
1. 평균 세포 수 산출
• 각 DF의 대표시료의 반복 측정값을 평균(또는 중앙값)으로 요약합니다.


2. 정밀도 평가 (Precision / CV)
• CV(%) = 100 x SD/Mean 으로 반복성을 수치화 합니다.
• DF별 CV를 함께 제시해 농도 의존적 변동을 확인합니다.
• CV가 낮을수록 정밀도가 높음을 의미합니다.


3. 적합도 확인 (R²)
• 희석 비율과 세포 수의 선형 적합도(R²)를 계산하되, 참고 지표로만 사용합니다.
• R²는 무작위 변동과 체계적 불비례를 구분하지 못하므로, 합격/불합격 판단에 단독 사용하지 않습니다.


4. 비례성 지수 (Proportionality Index, PI) 계산
• 실제 데이터가 이론적 희석-세포수 비례 관게에서 얼마나 체계적으로 벗어나는지를 수치화 합니다. (보통 평활화 잔차 기반)
• 선택한 계산식과 해석방향(작을수록/클수록 양호)를 함께 명시하고, 가능하면 95% CI를 제시합니다.
• PI는 비례성 관점의 핵심 지표이며, 장비 전반 성능을 단독 대변하지 않습니다.

그림 2. CV, R2, PI 한눈에 보기(예시 데이터).
빨간 선은 원점 회귀선, 회색 밴드는 ±PI(mean), 파란 라벨은 DF 별 CV(%), 초록 점은 각 DF의 평균을 나타냅니다. 오른쪽의 R2는 전체 희석 시리즈의 선형 적합도(참고 지표) 입니다. 표시된 수치는 설명을 위한 예시 값입니다.

3. 결과 보고 (Reporting)
ISO 20391-2는 단순히 분석으로 끝나지 않고, 연구자가 결과를 투명하게 문서화하도록 요구합니다.
• CV, R², PI 같은 품질 지표를 명확히 보고합니다.
• 실험 설계(희석 단계, 반복 횟수, 분석 방법)를 기록합니다.
• 시료 처리 방식과 측정 조건까지 함께 기재해 재현성을 보장합니다.

요약하면, ISO 20391-2의 절차는 다음과 같습니다.
“희석 시리즈 설계 → 시료 준비 → 반복 측정 → 통계 분석(CV·R²·PI) → 결과 보고”

ISO 20391-2의 장점과 한계

장점

• 실제로 연구자가 다루는 해당 세포를 대상으로 직접 통계를 내기 때문에, 방법의 정확도를 가장 정면에서 검증할 수 있습니다.
• 반복성·재현성·비례성을 수치로 제시해, 내가 쓰는 카운팅 방법이 신뢰할 만한지 객관적 근거를 마련합니다.
• 공통 지표(CV, R2, PI)로 결과를 보고하므로 연구실 간 비교와 다기관/규제 대응에서 설득력이 높습니다.

단점

• 신뢰성 있는 결론을 위해 충분한 N수와 반복 측정이 필요해, 시간·시료·인력 투입이 큽니다.
• 세포 유형별 특성이 달라서, 한 세포에서 얻은 결과를 다른 세포에 일반화하기 어렵고, 세포가 바뀌면 동일 절차를 다시 수행해야 합니다.
• 장비의 데일리 QC 용도로 쓰기엔 절차가 장황하고 비효율적입니다(연구 방법 검증에는 탁월하지만, 일상 점검에는 과함).
• 통계 설계와 해석의 부담이 있습니다. 예를 들어 DF(희석 단계) 설계, PI 계산 및 해석, 신뢰구간(CI) 산출 등 최소한의 통계 역량이 요구됩니다.
• 참조물질(Reference material)과 표준 비드의 확보·보관·로트 간 일치성에 현실적 제약이 존재합니다. 공급 이슈나 보관 조건, 로트 간 편차가 결과 해석을 어렵게 만들 수 있습니다.

결론 : ISO 의 엄격함 + 일상 QC의 실용성

ISO 20391-2는 세포 카운팅 QC에서 데이터 신뢰성을 수치로 증명하는 국제적 기능을 제공합니다. 반복성·재현성·실험실 간 변동성을 통계적으로 평가해, 연구자가 자신의 카운팅 방법이 얼마나 신뢰할 만한지를 명확히 보여줄 수 있습니다. 이는 국제 비교 가능성을 높이고, 규제·협업 상황에서 신뢰받는 근거가 됩니다.

하지만 실제 현장에서는 통계 설계/분석의 부담과 참고물질 운용의 제약이 존재하며, 매일의 장비 점검까지 이 프레임으로 수행하기엔 과도한 부담이 따릅니다.

따라서 실험실에서는 다음의 이원화 전략이 현실적입니다.
1. ISO 20391-2로 ‘내 방법’을 검증해 근본 신뢰성을 확보하고,
2. 일상 QC은 Validation Slide 같은 간단·재현 가능한 표준 물질로 짧고 일관되게 수행합니다.

즉, 국제 표준이 제시하는 원칙과 실험실에서 바로 적용 가능한 QC 도구를 적절히 결합할 때, 비로소 신뢰성과 효율성을 동시에 확보할 수 있습니다.

자주 묻는 질문 (FAQ)

Q1. ISO 20391-2는 꼭 따라야 하나요?

A. 반드시 의무는 아니지만, 연구 데이터의 신뢰성과 국제 비교 가능성을 확보하기 위해 점점 더 많이 요구되고 있습니다. 특히 다기관 연구, 규제 대응, 세포치료제 개발 환경에서는 큰 장점이 됩니다.

Q2. ISO 20391-2와 ISO 20391-1의 차이는 무엇인가요?

A. ISO 20391-1은 장비가 정상적으로 작동하는지(IQ/OQ/PQ)를 확인하는 절차이고, ISO 20391-2는 세포 카운팅 방법(Method) 자체의 신뢰성을 실험 설계와 통계 지표(CV, R², PI)로 검증합니다

Q3. Daily QC도 ISO 20391-2로 해야 하나요?

A. 아닙니다. ISO 20391-2는 method validation에는 탁월하지만, 매일의 QC까지 적용하기에는 절차가 과도하게 복잡합니다. 일상 점검은 Validation Slide 같은 표준 물질을 활용하는 것이 훨씬 실용적입니다

Q4. CV, R², PI는 각각 어떤 의미인가요?

• CV : 동일 조건 반복 측정 시 결과의 일관성(정밀도)
• R² : 희석 시리즈와 결과값의 선형 적합도(참고 지표)
• PI : 희석 비례 관계에서 얼마나 벗어나는지 보여주는 지표
이 세 가지 지표를 함께 제시해야 카운팅 방법의 신뢰성을 객관적으로 보여줄 수 있습니다.

영어버전 (English ver.)을 보시려면 클릭하세요.

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