정기적인 세포 배양 과정 중에 세포의 건강 상태와 성장 상태를 모니터링 하는 것은 매우 중요합니다. 세포 생존도를 정기적으로 측정함으로써 연구자들은 세포가 문제없이 배양되고 있는지 확인할 수 있습니다. 특히 예민한 세포의 경우 갑자기 오염되거나 건강 상태가 악화되는 경우가 있기 때문에 성장조건이 민감한 세포의 경우 주기적인 세포 생존도 측정은 필수적이라 하겠습니다.
세포 생존도 측정은 비단 세포를 계대배양 함으로 장기간 유지하고자 하는 목적에만 필요한 것이 아닙니다. 특정한 실험을 설계하고 이 실험을 위해 세포를 준비해야 할 경우 잘 컨트롤 된 세포 숫자와 건강한 세포를 준비하는 것은 이후 실험의 성패에 많은 영향을 줍니다. 부실하게 배양된 세포는 부정확한 결과를 초래할 수 있으므로 실험을 수행하기전에 세포의 상태를 확인하는 것은 매우 중요합니다. 세포 생존도 측정을 통해 연구자들은 부실한 세포를 폐기하거나 건강 상태를 개선하기 위한 사전 조치를 취할 수 있습니다.
또한 세포 생존도 측정은 실험 조건을 최적화하는 데 사용할 수 있습니다. 다양한 실험 조건에서 세포 생존도를 측정함으로써 연구자들은 세포 성장에 필요한 최적의 조건을 결정할 수 있게 됩니다. 이는 특히 세포의 생존도가 의약품의 품질을 결정하는 대량 생산 공정에서 대단히 중요한 역할을 합니다.
신약 개발 과정에서 세포 생존도 측정은 잠재적인 약물 후보 물질을 선별하고 이 물질들이 세포 생존도에 미치는 영향을 평가하는데 사용됩니다. 후보물질의 다양한 농도 구간에 노출된 세포의 생존도를 측정함으로써 연구자들은 대상 세포에 원하는 효과를 보이면서 정상세포에는 영향이 적은 후보물질을 선별할 수 있게 됩니다.
세포 생존도 측정은 또한 약물 후보물질의 최적 용량을 결정하는데 사용하고 있습니다. 다양햔 농도의 약물에 노출된 세포의 생존도를 측정함으로써 연구자들은 치료 효과를 극대화 하면서 잠재적 독성이 최소화된 최적의 용량을 결정할 수 있습니다.
또한 세포 생존도 측정은 후보물질의 잠재적 부작용을 식별하는데도 유용하게 사용되고 있습니다. 다양한 농도의 약물에 노출된 세포의 생존도 측정을 통해 잠재적 독성 및 부작용을 식별할수 있게 되며 이러한 독성을 최소화 하기 위해 제형을 변경하거나 약물의 용량을 조정할 수 있습니다.
결론적으로 세포 생존도 측정은 신약개발 과정에서 빈번하게 사용되는 매우 중요한 기술입니다. 세포의 생존도를 정확하게 측정함으로써 연구자들은 잠재적 약물 후보물질은 선별하고, 이들의 용량과 효능을 최적화하며, 잠재적 부작용을 최소화할수 있어 효과적인 약물 개발이 가능하도록 합니다.
독성학 연구에서 세포 생존도 측정은 물질이 세포에 미치는 영향을 평가하는데 사용됩니다. 다양한 농도의 물질에 노출된 세포의 생존도를 측정함으로써 연구자들은 물질이 동식물에 미치는 잠재적인 영향을 평가할 수 있습니다.
세포 생존성 측정은 또한 물질의 독성 기작을 밝혀내는 데 유용합니다. 다양한 농도의 물질에 노출된 세포의 생존성을 측정하고 세포 형태와 기능의 변화를 분석함으로써 연구자들은 독성 기작을 식별하고 물질이 생물체에 어떻게 영향을 미치는지 더 잘 이해할 수 있습니다.
또한, 세포 생존도 측정은 독성 물질에 노출된 동식물의 치료법을 개발하거나 치료의 효능을 평가하는 데 유용합니다. 다양한 농도의 치료제를 사용한 후 세포의 생존성을 측정함으로써 연구자들은 독성 물질의 영향을 최소화하기 위한 최적의 용량과 치료 전략을 결정할 수 있습니다.
결론적으로, 세포 생존도 측정은 독성학 연구에서도 중요한 기술입니다. 세포의 생존도를 정확하게 측정함으로써 연구자들은 물질의 잠재적 독성을 식별하고, 생물체에 대한 그들의 영향을 평가하며, 그 영향을 최소화하기 위한 효과적인 치료 전략을 개발할 수 있습니다.
트리판 블루 염색은 세포 생존율 측정에 가장 많이 사용되는 방법입니다. 이 방법은 살아있는 건강한 세포는 트리판 블루와 같은 염료의 침투를 방지하는 세포막을 가지고 있다는 원리에 기초합니다. 반면, 죽거나 손상된 세포막을 가진 세포는 염료가 침투하여 세포 내부의 단백질과 결합하여 세포를 염색하게 됩니다.
Trypan blue dye는 약 960 Da 크기의 음전하를 띄고 있는 수용성 분자입니다. 이러한 특성의 dye 는 세포막을 투과하기에 크기가 크며 지질 이중막을 통과하기 어렵습니다. 일반적으로 살아있는 세포의 세포막을 잘 투과하는 분자의 크기는 600 Da 이하로 알려져 있으며 이보다 큰 분자는 세포의 선택적 투과능력에 의해 세포 내부로 들어가기 어렵습니다.
트리판 블루 염색은 보통 0.4% 의 트리판블루 용액과 세포 현탁액을 1:1 로 섞어서 진행합니다. 트리판 블루의 염색은 대단히 빠른 시간에 완료되기 때문에 수 분을 넘어서는 장시간의 인큐베이션은 바람직하지 않습니다. 염색된 세포 현탁액은 헤모사이토미터 (hemocytometer) 에 주입하여 현미경에서 카운팅 할수 있습니다. 이때 사용하는 헤모사이토미터는 고정된 부피값을 가지고 있기 때문에 세포 현탁액에 존재하는 세포의 농도를 계산할 수 있으며 viability 도 쉽게 측정할 수 있습니다. 오늘날 대부분의 실험실에서는 이러한 과정을 자동으로 수행해주는 자동세포 계수기 (automated cell counter) 가 보급되어 있습니다. 자동세포 계수기는 살아있는 세포와 염색된 죽은 세포를 영상 분석을 통해 정확히 구분할 수 있기 때문에 사용자의 에러와 피로도를 줄여줍니다. (자동세포기를 사용해야 하는 이유에 대해서는 “Top 10 Reasons to Invest in Automated Cell Counters for Accurate and Efficient Research” 문서를 참고하시기 바랍니다.
트리판블루 염색법이 세포 생존율을 평가하는데 널리 사용되어온 방법이지만 여러 가지 단점도 있습니다.
첫째, 세포상태에 따라 결과의 정확성이 떨어질수 있습니다. 예를 들어, 일시적으로 투과성이 있는 세포막을 가진 세포는 죽지 않았음에도 불구하고 트리판 블루로 염색될 수 있습니다.
둘째, 자동 셀카운터를 사용하지 않는 트리판블루 염색법은 세포를 수동으로 세어 생존 세포의 백분율을 계산해야 하므로 처리 속도가 느릴 수 있습니다. 이로 인해 시간과 노력이 많이 들어가게 되며, 큰 샘플 규모의 실험에서는 더욱 비효율적입니다.
셋째, 트리판블루 염료 자체가 세포에 독성을 가질 수 있어, 장시간 노출시 세포에 영향을 줄 수 있습니다.
넷째, 생체조직에서 채취한 primary cell 로 cell counting 을 할 경우 적혈구와 염색된 죽은 세포가 잘 구분되지 않습니다. 이 경우 연구자는 적혈구를 죽은 세포로 카운팅하여 샘플의 세포 생존율이 대단히 낮은 것으로 오인할 수 있습니다.
다섯째, 트리판블루의 독성은 세포카운팅의 결과 뿐 아니라 염료를 사용하는 사용자에게도 건강상 위험요인이 됩니다. 유럽의 많은 국가들은 이미 trypan blue 의 독성에 대해 주목하고 있으며 실험실 내 사용을 제한하고자 하는 움직임이 있습니다. 트리판블루의 대체 시약으로 독성이 현저히 낮은 시약은 에리쓰로신 B (Erythrosin B) 가 있으며 이미 세포카운팅과 세포생존율 측정에 사용되고 있습니다. Erythrosin B의 분자량은 879.9 Da 로 살아있는 세포의 세포막을 투과하지 못하고 죽어있는 세포만 염색한다는 점에서 트리판블루의 염색원리와 동일합니다.
형광 염료 염색법은 형광 염료를 사용하여 살아있는 세포와 죽어 있는 세포를 구별하는 방법으로 트리판블루와 달리 세포막에 투과성을 가진 형광 염료와 세포막에 대한 투과성이 없는 형광염료를 다양하게 조합하여 사용합니다. 예를 들어 가장 널리 사용되는 AOPI 염색법은 살아있는 세포에 투과성을 지닌 아크리딘 오렌지 (Acridine Orange, AO) 와 투과성이 없는 프로피디움 요오드 (Propidium Iodide, PI) 를 조합하여 세포를 염색하는데 AO 는 살아있는 세포와 죽은 세포 모두를 염색하고 PI 는 죽은 세포만 염색하게 되는 원리를 이용하여 세포 생존율을 계산합니다. 또는 AO 와 같이 세포에 투과성이 좋은 dye 중에서 살아있는 세포내에서만 선택적으로 발광을 하게 되는 특성을 지닌 염료를 사용하여 살아있는 세포만 카운팅하는 방법도 있습니다. 아래에서 세포 생존율 측정을 위한 다양한 형광 염료 염색법에 대해 기술해보겠습니다.
1) AOPI 염색법 (Acridine orange/Propidium Iodide Staining, AOPI staining)
아크리딘 오렌지/프로피듐 요오드(AOPI) 와 같은 형광 염료 염색은 세포 생존율 측정에 흔히 사용되는 또 다른 방법입니다. 이 방법은 생존 세포와 비생존 세포를 구분할 수 있는 두 가지 형광 염료, 아크리딘 오렌지와 프로피듐 요오드를 사용합니다. AOPI 염료 염색을 사용하여 세포 생존율을 측정할 때, 생존 세포는 녹색 형광을 발산하고, 사멸 또는 손상된 세포는 적색 형광을 발산합니다. 형광 현미경이나 흐름 세포 계량법을 사용하여 생존 세포와 비생존 세포를 구별하고 세포 집단에서 생존 세포의 비율을 계산할 수 있습니다.
아크리딘 오렌지 (Acridine Orange, AO) 는 분자량 265 Da 의 저분자 물질로 세포막을 비교적 자유롭게 투과할수 있으며 세포 내 핵산에 선택적으로 결합합니다. DNA 에 결합된 AO 는 약 500 nm 파장에서 최대로 여기 (peak excitation) 되어 525 nm 의 파장에서 peak emission 을 보입니다.
한편 프로피듐 요오드 (Propidium Iodide, PI) 는 분자량 668 Da 의 물질로 AO 와 달리 세포막을 자유롭게 투과할 수 없습니다. PI 역시 세포내 핵산에 결합하는 특성이 있으며 DNA 에 결합된 PI 는 535 nm 파장에서 peak emission, 617 nm 에서 peak emission 값을 갖습니다.
이러한 두 종류의 dye 의 특성에 기반하여 세포를 두가지 dye 로 동시 염색하게 된다면 AO 는 모든 세포를 투과해서 핵산에 결합하며, PI 는 죽어있는 세포의 핵산에만 결합하게 됩니다. 이후 500 nm 근처에서 excitation 후 530 nm 근처에서 emission 을 관찰한다면 AO 의 형광이 관찰되며, 530 nm 파장에서 excitation 후 620 nm 근처에서 emission 을 관찰한다면 PI 의 형광을 관찰할 수 있습니다. 살아있는 세포는 AO 만을 투과시키기 때문에 AO 의 형광이 초록색으로 관찰되지만 죽어있는 세포는 AO 와 PI 모두 투과시키기 때문에 이론적으로는 두 개의 형광이 모두 관찰 될수 있습니다. 그러나 죽어있는 세포에서 AO 와 PI 가 DNA 를 동시에 염색할 경우 AO 의 emission 은 PI 의 excitation source 로 작용하는 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 현상에 의해 그 형광이 관찰되지 않으며, 죽은 세포에서는 PI 의 형광만 선택적으로 관찰되게 됩니다. 형광 현미경 또는 형광 현미경 원리를 차용하고 있는 자동 세포 카운터에서 관찰한다면 살아있는 세포는 AO 의 초록색 형광이, 죽어있는 세포에서는 PI 의 붉은색 형광이 보이게 됩니다.
2) FDA/PI 염색법
FDA (Fluorescein diacetate) 는 초록색 형광을 내는 대표적인 형광 염료인 fluorescein 의 유도체로 일반적 조건에서는 형광을 발산하지 않도록 디자인 되어있습니다. FDA 는 분자량 416 Da 의 저분자로 세포막을 비교적 자유롭게 투과할 수 있으며, 세포내의 에스트레이즈 (esterase) 효소에 의해 분해되어 fluorescein 을 방출합니다. 따라서 살아있는 세포를 FDA 로 염색한다면 세포막을 투과한 FDA 가 세포내 esterase 에 의해 분해되어 초록색 형광을 내게 됩니다. 반면 죽어있는 세포의 경우 esterase 효소의 활성이 없기 때문에 FDA 는 intact 상태로 존재하게 되어 형광을 발산하지 않습니다.
FDA 는 죽어있는 세포를 선택적으로 표지할 수 있는 PI 와 함께 사용되어 살아있는 세포에서는 fluorescein 의 초록색 형광을, 죽어있는 세포는 PI 의 붉은색 형광을 관찰하여 세포 생존도를 쉽게 측정할 수 있습니다.
FDA 와 유사한 방식으로 작동하는 dye 로는 Calcein-AM 이 있으며 Calcein-AM 역시 세포 내 esterase 에 의해 분해되어 형광을 띄게 됩니다.
MTT assay는 생존 세포 내 미토콘드리아 탈수소효소에 의해 노란색 테트라졸류염염료 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드)가 보라색 포르마잔 결정체로 환원되는 원리에 기초해서 세포 생존도를 측정하는 방법입니다.
MTT assay를 수행하는 통상적인 방법은 아래와 같습니다. 우선 세포를 well plate에 씨드하고 부착 및 성장시킨 뒤 테스트하고자 하는 약물을 처리한 이후에, MTT 용액을 각 웰에 첨가하고 몇 시간 동안 MTT가 대사되도록 인큐베이션합니다. 이후, 살아있는 세포 내에서 생성된 포르마잔 결정체를 측정합니다. 포르마잔 결정체를 정량적으로 분석하기 위해서는 이를 용해시킬수 있는 용액을 첨가해야 하는데 주로 DMSO 나 산성 에탄올, 산성 SDS 등을 사용합니다. 용해된 포르마잔은 마이크로플레이트 리더기 또는 스펙트로포토미터 등을 이용해 570nm 파장에서 흡광도를 측정하여 생성량을 측정할 수 있으며 그 생성량은 생존세포 수에 비례합니다.
MTT assay의 가장 큰 장점은 세포가 부착된 상태에서 생존도를 비교적 빠르고 쉽게 측정할 수 있다는 점입니다. 그러나 이 방법은 미토콘드리아 기능을 기반으로 하기 때문에 손상되거나 기능이 이상한 미토콘드리아를 가진 세포의 생존도를 정확하게 반영하지 못할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 세포 밀도, 인큐베이션 시간, pH 등의 요인에 영향을 받을 수 있으며, 결과의 정확성에 영향을 미칠 수 있습니다. 무엇보다 MTT assay 의 가장 큰 단점은 대조군이 필요하다는 점입니다. 대조군 대비 처리군에서 세포의 생존도를 쉽게 평가할 수는 있지만 대조군이 없는 상태에서는 생존도를 계산할 수 없습니다. 예를 들어 현재 배양중인 세포의 cell viability 가 얼마나 되는지 MTT assay 로는 측정할 수는 없습니다.
Kim et al., Application of a non-hazardous vital dye for cell counting with automated cell counters, Anal Biochem, 2015
A W Krause, et al., Fluorescent erythrosin B is preferable to trypan blue as a vital exclusion dye for mammalian cells in monolayer culture, J Histochem Cytochem, 1984
